Ve hře Macbeth hraje Lady Macbeth zásadní roli ve smrti krále Duncana. Je to ona, kdo přesvědčí Macbetha, aby zavraždil krále, a pomůže mu naplánovat a provést čin.
Poté, co Macbeth vyjádří své pochybnosti a obavy ze zabití krále, Lady Macbeth mu vyčítá, že je zbabělec, a zahanbí ho, aby spáchal zločin. Poukazuje na to, že už měl nápad zabít Duncana a že váhá jen kvůli své „slabé povaze“. Připomíná mu také jeho ambice stát se králem a říká mu, že pokud chce dosáhnout svých cílů, musí být nemilosrdný.
Odhodlání a manipulace lady Macbeth nakonec přesvědčí Macbetha, aby souhlasil s jejím plánem. Vysvětlí podrobnosti o vraždě, včetně toho, jak a kdy by měla být provedena. Také řekne Macbethovi, aby nechal krvavé dýky u Duncanova těla, takže vina padne na královy stráže.
Poté, co je vražda spáchána, je Lady Macbeth zpočátku přesvědčena, že ji budou schopni utajit. Brzy však začne vykazovat známky viny a šílenství. Začne být posedlá krví na rukou a nemůže spát. Začne mít také vize ducha Duncana, který ji obviní z vraždy.
Vina lady Macbeth se nakonec stane příliš velkou, než aby ji unesla. Umírá ve čtvrtém dějství hry a její smrt je pro Macbetha zlomem. Stává se ještě bezohlednějším a tyranským a nakonec ztrácí rozum.
Role lady Macbeth ve smrti krále Duncana je významná, protože zdůrazňuje sílu ctižádosti a nebezpečí, když dovolíme svým touhám překonat své morální zásady. Je to složitá a tragická postava, kterou nakonec zničí její vlastní ambice a vina.