Florey se narodil v Adelaide v Jižní Austrálii jako syn ředitele školy. Navštěvoval St Peter's College v Adelaide a University of Adelaide, kde v roce 1921 získal bakalářský titul a v roce 1924 doktorát medicíny.
Po dokončení lékařského studia Florey pracoval na Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research v Melbourne, kde se setkal s Ernstem Chainem. V roce 1928 se přestěhovali na sir William Dunn School of Pathology na univerzitě v Oxfordu, kde začali pracovat na vývoji penicilinu.
Penicilin objevil v roce 1928 Alexander Fleming, ale nevyvinul se z něj použitelný lék. Floreymu a Chainovi se podařilo izolovat účinnou látku penicilin a vyčistit ji tak, aby ji bylo možné aplikovat pacientům. Vyvinuli také metody pro hromadnou výrobu penicilinu, což umožnilo jeho široké použití během druhé světové války.
Práce Floreyho a Chaina o penicilinu zachránily během druhé světové války nespočet životů a způsobily revoluci v léčbě infekčních nemocí. Florey získal Nobelovu cenu za fyziologii a medicínu v roce 1945 a v roce 1944 byl povýšen do šlechtického stavu.
Florey byl také význačný správce a pedagog. V letech 1959 až 1962 působil jako vicekancléř Oxfordské univerzity a v letech 1960 až 1965 byl prezidentem Royal Society of London. Byl také členem Australské akademie věd, Americké akademie umění a věd. a Národní akademie věd.
Florey zemřel na mrtvici v Oxfordu v roce 1968. Je považován za jednoho z nejvýznamnějších australských vědců 20. století a jeho práce o penicilinu zachránila miliony životů.